Методика приготовления мазков крови для выявления паразитов у собак и кошек
Мазки крови исследуют с целью выявления некоторых кровепаразитов. Мазок должен быть приготовлен правильно и окрашен высококачественным красителем. Его обязательно делать сразу после взятия крови у животного.
Антикоагулянты приводят к артефактам, затрудняя интерпретацию результатов, особенно при выявлении паразитов на поверхности эритроцита, например, Haemobartonella felis, которые могут удаляться с поверхности красных кровяных клеток.
Для окраски подходят любые красители типа Романовского (Гимзы, Лейшмана).
Данным методом можно определить такие организмы, как Haemobartonella felis, H. canis, babesia canis, Leishmania infantum, Ehrlichia canis и Dirofilaria immitus.
Haemobartonella felis можно также определять при окраске некоторыми ядерными красителями. Чаще всего используют акридиновый оранжевый.
Методики концентрации микрофилярий
Существует несколько методов концентрирования кровепаразитов. Наиболее широко используется модифицированный метод Кнотта. Кроме того, есть готовые тест-системы для концентрирования методом фильтрации. Отрицательные результаты, полученные данным методом, недостоверны; примерно у 25% собак, зараженных сердечными гельминтами, микрофилярии в крови отсутствуют.
Оборудование:
Шприц 2 мл, игла № 23, несколько предметных стекол, одно стекло для размазывания (его можно изготовить, отрезав уголок обычного стекла стеклорезом), краситель типа Романовского.
Приготовление красителя:
Май-Грюнвальда
- Поместите 0,3 г порошка в 200–250 мл колбу.
- Добавьте 100 мл метанола и подогрейте до 50 °С.
- Остудите до комнатной температуры, встряхивайте несколько раз в течение дня.
- После отстаивания в течение 24 часов профильтруйте.
Гимзы
- Поместите навеску порошка массой 1 г в колбу.
- Добавьте 100 мл метанола и подогрейте до 50 °С.
- Сохраняйте такую температуру в течение 15 минут при периодическом встряхивании, зачем профильтруйте.
- При отстаивании качество красителя улучшается.
Буферный раствор Соренсена
- А. 9,1 г/л КН2РО4
- В. 9,5 г/л Na2HРО4 или 11,9 г/л Na2HРО4 • 2 Н2О
- Для получения раствора с рН 6,8 смешайте 50,8 мл раствора А с 49,2 мл раствора В.
Методика.
1. Возьмите 1 мл крови иглой № 23.
2. Нанесите небольшую каплю крови на концы обоих стекол.
3. Возьмите третье стекло и прикоснитесь им к капле крови на предметном стекле; угол наклона стекла должен быть около 45°.
4. Быстро размажьте каплю по всей длине стекла. Мазок должен быть гладким. Повторите то же самое со вторым стеклом.
5. Высушите мазки на воздухе.
6. Зафиксируйте метанолом в течение 10–20 минут.
7. Поместите в емкость с красителем Май-Грюнвальда, разведенного равным объемом буфера; краситель разводят непосредственно перед окрашиванием.
8. Через 15 минут, не смывая, переместите мазок в емкость с красителем Гимзы, разведенным девятикратным объемом буфера; краситель разводят непосредственно перед окрашиванием.
9. Спустя 10–15 минут перенесите стекло в стакан с буфером и промойте 3–4 раза, после каждой промывки наливая свежую воду.
10. Оставьте в буфере на 2–5 минут.
11. Поставьте стекла вертикально для просушки.
12. Можно использовать экспресс-красители, в соответствии с инструкцией производителя, но качество будет хуже.
Примечания.- Капля должна быть небольшой; тонкие мазки лучше толстых.
- Игла небольшого диаметра позволяет лучше контролировать размер капли, при осторожном взятии крови повреждения красных кровяных клеток можно свести к минимуму.
- Осадок красителя легко принять за паразитов на поверхности эритроцита, например, за Haemobartonella felis или H.canis.
Окраска акридиновым оранжевым
Методика.
1. Смешайте 100 мкл цельной крови с 100 мл акридинового оранжевого, свежеразведенного в боратном буфере Соренсона с рН 9,0, в соотношении 1:20000.
2. Нанесите каплю смеси на предметное стекло, очищенное спиртом, и накройте покровным стеклом.
3. Оставьте на 5 минут во влажной атмосфере и просмотрите под микроскопом в ультрафиолетовом свете. До микроскопии держите стекла в темном месте.
ИЛИ
1. Залейте стекло, высушенное на воздухе, раствором акридинового оранжевого и оставьте на 5 минут.
2. Просмотрите под микроскопом в ультрафиолетовом свете.
Небольшие флуоресцирующие включения на поверхности эритроцитов – признак присутствия гемобартонелл.
Модифицированный способ Кнотта
Методика
1. Смешайте 1 мл цельной крови с 10 мл 2%-ного раствора формальдегида и оставьте на 15 минут.
2. Отцентрифугируйте смесь 5 минут при скорости 1500 об/мин.
3. Удалите надосадочную жидкость и суспендируйте остаток в капле метиленового синего, разведенного 1:1000.
4. Нанесите небольшую каплю смеси на предметное стекло и накройте покровным стеклом.
перейти к списку>>
