ветеринарная медецина - консультация
крестик
телефон
восклицание
карандаш
форум
Реклама:

 


Цепная полимеразная реакция 

цепная полимеразная реакция

Цепная полимеразная реакция (ЦПР) позволяет многократно реплицировать ДНК, содержащуюся в очень малой концентрации, при помощи фермента – термостабильной ДНК-полимеразы, создающей копию молекулы на матрице ДНК.

Участком начала амплификации служит короткий участок ДНК, так называемый праймер, связанный со специфичной областью ДНК микроорганизма.

После каждой фазы полимеризации реакционную смесь нагревают для разъединения цепей ДНК, и, таким образом, появляются новые участки для связывания праймеров и запуска новых циклов полимеризации.

Амплифицированную ДНК затем отделяют от смеси нуклеотидов в геле. Это можно сделать различными способами (чаще всего с помощью окраски красителем, флуоресцирующем в ультрафиолетовом свете).

Эта технология может применяться и для определения РНК-содержащих вирусов; в этом случае сначала добавляют обратную транскриптазу, создающую ДНК-копию вирусной РНК.

Принцип «обратной ЦПР» (Обратная цепная полимеразная реакция это модификация ЦПР, в которой фермент обратная транскриптаза синтезирует одноцепочечную ДНК на матрице РНК. Комплементарная ДНК образуется в одиночном цикле полимеризации.).  

Главным преимуществом этого метода является его высокая чувствительность.

Теоретически возможно определить одиночный организм, но на практике часто требуются большие их количества, до нескольких сотен.

Метод ЦПР очень специфичен (имеющиеся праймеры подвергаются тщательному отбору).

Главный недостаток метода ЦПР – возможность ложноположительных результатов из-за высокой чувствительности. Причиной может служить контаминация образца, праймеров, фермента или нуклеотидов. И если лаборатории могут контролировать контаминацию своих реагентов, то контаминация образца возможна в процессе работы.

Высокая чувствительность затрудняет интерпретацию положительных результатов.

Большинство тест-систем на основе ЦПР предназначены для качественного анализа, хотя возможен и полуколичественный. Качественный анализ показывает только наличие или отсутствие организма.

При некоторых инфекциях присутствие микроорганизмов в небольшом количестве не имеет клинического значения, и, следовательно, при использовании метода ЦПР возможна гипердиагностика.

Другая проблема, не столь значительная, возникает из-за высокой специфичности реакции. Подбор неподходящих праймеров может дать ложноотрицательный результат.

цепная полимеразная реакция

При методе обратной ЦПР ложноотрицательный результат может получиться в результате разрушения РНК посторонними ферментами. Праймеры нужно получать из ДНК с известной последовательностью, не менее нескольких лет определяемой у вирусов различных штаммов, происходящих из различных географических районов.

Некоторые патогенные бактерии, плохо растущие в культуре, идентифицируются методом ЦПР. Один из самых известных примеров – Bartonella henselae, вызывающая бактериальный ангиоматоз («болезнь кошачьих царапин» у человека. Метод ЦПР позволяет определить бартонеллы прямо в крови кошки, в то время как для роста культуры требуется несколько недель. Эту технологию используют также для определения Chlamiydophila felis; описаны методики определения сальмонелл и кампилобактерий.  

На данный момент существуют тест-системы для диагностики широкого спектра возбудителей, включая вирусы лейкоза, иммунодефицита, герпесвирус и коронавирус кошек, парвовирус собак, Clamiydophila felis (ранее Chlamidia psittaci var. Felis) и Haemobartonella felis. В будущем их станет больше.

При интерпретации результатов, полученных данным методом, нужно всегда учитывать клиническую информацию; не следует ставить диагноз только по результатам ЦПР.

Ян Рэмси, Даниелла Ганн-Мур и Сюзан Шоу 

 

 

перейти к списку>> 

 

Статьи по теме:

Другие статьи:


 

 


 

Вся информация на сайте предоставлена в ознакомительных целях. По вопросам диагностики, лечения и профилактики болезней животных необходимо обращаться к ветеринарным специалистам. Любое использование материалов без активной ссылки на сайт doktorvet.com запрещено!

©"DoktorVet.com", 2013-2015