Метод альтернативного варирования при оценке подвижности спермиев быков
Условием достоверности различия двух сравниваемых выборок с заданным уровнем надежности (при проведении исследований со сперматозоидами млекопитающих) является критерий Стьюдента (t). Формулу определения достоверности различия выборок (t) можно преобразовать в следующую зависимость (1):
, .............................
, ·(1)
где: t - критерий Стьюдента, М1 и М2 - подвижность спермиев в опытной пробе и контроле, m1 и m2- ошибки среднеквадратического отклонения, соот-ветственно, m1- максимальная ошибка среднеквадратического отклонения сравниваемых выборок, 
М - минимальная разность величин сравниваемых выборок обеспечивающая достоверный результат.
Процент подвижности спермиев в пробе и его ошибка вычисляется из следующих формул:
, · (2) ..........
, · (3), ............
, · (4)
где: n - общее количество спермиев в оцениваемой пробе, n1- количество подвижных спермиев, m - величина ошибки среднеквадратического отклонения, 
- среднеквадратическое отклонение, оцененное по методу альтернативного варьирования.
Точность вычисления среднего значения (М) определяется по формуле:
, ..................
, · (1а)
Подставив в формулу Ф(7) значение ошибки среднеквадратического от-клонения полученное из формулы ф(1). Определим величину максимальной точности определения подвижности спермиев (
Таким образом, при выборе оптимального метода оценки подвижности сперматозоидов, следует учитывать вероятную величину расхождения сравниваемых проб (М), которая в полтора раза должна превышать точность оценки метода (). Например, если в ходе проведения поисковых опытов, разница в контроле и опыте (М) составляет пять процентов, то вполне можно обойтись методом, который обеспечивает точность определения подвижности () в три процента (таблица 1). Используя метод видеосъемки оцениваемых проб подвижности спермиев можно получить и более высокую точность (), при увеличении количества подсчитываемых спермиев (n).
Минимальное количество спермиев которое необходимо оценить (n) при условии обеспечения необходимой точности () можно определить из формул Ф(3, 4, 7).
, · (8)
Таблица 1. Необходимые условия получения достоверного результата с условием надежности 0,95 при оценке подвижности спермиев в сравниваемых образцах.
*- данные представленные для одного образца
При условие надежности принятом в биологических исследованиях (Р=0,95), когда критерий Стьюдента приблизительно равен двум (t=2 при n больше или равно 30) выражения 1, и 8 упрощаются:
где: n2 — минимальное количество спермиев, которое необходимо оценить для отдельно взятой выборки. Данная величина необходима для сравнения образцов полученных из различных экспериментов проведенных при разных условиях.
Получение достоверного значения в двух пробах от разности их средних величин можно оценить при помощи следующей формулы:
, · (8 в)
Поскольку среднеквадратическое отклонение () при использовании метода альтернативного варьирования зависит от средней величины (М) Ф(4), то необходимое количество измерений связано с данным параметром, который может изменяться от 0 до 100% (рисунок ).
Рис. 1 Зависимость минимального количества измерений необходимых для получения достоверности различия двух сравниваемых выборок от показателя расхождения средних величин сравниваемых выборок (М) при различной вероятности реализуемого события (М) (метод альтернативного варьирования при уровне надежности Р=0,95).
Количество спермиев попадающих в поле монитора, зависит от степени увеличения микроскопа и разбавление эякулята. Для сперматозоидов быков разбавленных по Харьковской технологии при увеличении в 200 раз данная величина составляет около ста (n=100±20). Следовательно, количество повторов проб (N) можно определить из следующей формулы:
Таким образом, для обеспечения точности вычисления подвижности спермиев в контроле и опыте от 5 до 2% необходимо от 6 до 40 проб. Если в среднем процедура подсчёта спермиев в одной пробе занимает около одной минуты, то в целом для анализа всего образца необходимо от 6 до 40 минут для обеспечения точности 5?2%, соответственно.
Для упрощения процедуры оценки анализируемых проб следует применять «диагональный» метод, используемый для подсчёта эритроцитов и лейкоцитов в плазме крови. Сокращение времени необходимого на проведение подсчета одной пробы в k раз возможно при увеличении числа разбивки поля монитора на заданное число секторов. Таким образом, число необходимого подсчета спермиев в пробе — n0 уменьшается также в k раз:
где: n- количество спермиев в поле монитора, k- количество секторов расположенных по диагонали, k2- общее количество секторов в поле монитора. Количество секторов не должно превышать число спермиев в пробе. Для подсчета удобно, если в один сектор попадает nк = 3?5 спермиев. Следовательно, количество секторов (k) оценивается по формуле (9в).
В нашем случае k=5 для n=100 и nк=4. Таким образом, количество подсчитываемых спермиев при использовании «диагонального» метода уменьшается в пять раз и во столько же время на проведение оценки (Таблица 2).
При использовании метода видеофиксации изображения, оценку подвижности спермиев в анализируемой пробе можно производить и после опыта. Высокая точность определения подвижности спермиев 2-3% необходима при разнице в сравниваемых выборках М= 3÷5%. Как правило, необходимость в этом встречается достаточно редко. Обычно, величина разницы сравниваемых выборок (М) составляет 5% и более, что соответствует трем повторам. В таком случае достаточно оценить не менее 900 сперматозоидов из анализируемого образца. Не менее трех повторов требуется также, чтобы исключить влияние разнокачественности проб находящихся в одном образце. Примером разнокачественности проб может служить такое явление как ”Swim up” характеризующее большую активность спермиев расположенных ближе к поверхности, чем у дна одного образца. Как правило, расхождения средних значений проб полученных от одного образца не превышают 2÷3%. В противном случае необходимо устанавливать и по возможности устранять причины вызывающие данные расхождения.
Таблица 2. Необходимые условия получения достоверного результата с условием надежности 0,95 при оценке подвижности спермиев в сравниваемых пробах, при подсчете "диагональным" способом
*- данные представленные для одной пробы
Для оценки разнокачественности проб следует использовать следующую формулу определения среднеквадратического отклонения:
где: М - подвижность спермиев в пробе, k-количество проб.
Обычно данная величина (к) для свежеполученной спермы в одном об-разце составляет около 2х процентов, а ошибка среднеквадратического откло-нения mк= 0,75% для семи проб (k=7). Для деконсервированных проб к = 4% и mк = 1,5%, что обусловлено влиянием различных условий замораживания данных проб.
 |
Таким образом, для получения статистически достоверного результата с высоким уровнем надежности (Р=0,95) достаточно использовать 20?50 мкл семени для сравнения двух проб при разнице сравниваемых значений в шесть и более процентов, при использовании метода видеосъемки анализируемых проб. При этом стоимость проведения исследования минимальна. Поскольку наибольшее количество проб (N=16) требуется для получения достоверного значения в одной отдельной выборке, то данный критерий рекомендуется использовать только в случае сопоставления образцов полученных от разных эякулятов или при различных условиях проведения эксперимента. |
| Фрагменты видеоизображений спермиев быков |
Таким образом, минимальные затраты на получение достоверного значения сравниваемых выборок соответствуют разнице их средних показателей в шесть и более процентов. Количество повторов измерения при этом составляет 3÷5 раз. Применение метода видеосъемки подвижности сперматозоидов млекопитающих позволяет повысить точность полученного результата от 5% до 2% при увеличении анализируемых проб от 4 до 25. Затраты времени составляют 1,5÷10 минут и денежных средств 2÷4 гривны для получения достоверного результата сравниваемых образцов.
перейти к списку>>
Статьи по теме:
- Как проводить оценку подвижности спермиев быков
- Методы оценки подвижности спермиев быков
- Контроль температуры при оценке спермиев у быков
Другие статьи: