Методы оценки подвижности спермиев быков
 |
Для оценки подвижности спермиев быков, сперму наносят на предметное стекло и смешивают с каплей подогретого до 35 0С 2,9-ного раствора цитрата натрия, после чего определяют активность под микроскопом. О характере движения спермиев можно судить при просмотре препарата на предметном стекле при увеличении под микроскопом в 120-280 раз. Нормальные спермии обычно движутся против тока жидкости (реотаксис). |
Ток жидкости легко создать на предметном стекле, слегка приподняв один из его углов. После этого можно наблюдать, как все активно перемещающиеся спермии устремляются против этого тока в одном направлении.
Спермии, обладающие до этого плохой подвижностью, продолжают передвигаться беспорядочно. Кроме того, поле зрения микроскопа лучше разделить на четыре равные части путем помещения в окуляр двух образцов конского волоса в виде перекрещивающихся под прямым углом диаметров. При этом легче выбрать более однородные места препарата, в которых ведется счет отдельно в каждой ? части.
Считаются все видимые спермии до 10, отдельно фиксируются спермии, имеющие прямолинейное поступательное движение. Для удобства учета спермиев в густой сперме к нанесенной на предметное стекло капле спермы добавляют каплю 1%-ного раствора поваренной соли или 2,8% раствора цитрата натрия. Капли необходимо тщательно смешать, если капли накрыть покровным стеклом, не перемешав, то в зону раствора перейдут подвижные спермии, что приведет к ошибке в оценке.
Одним из обязательных контролей поступающей в продажу замороженной спермы является определение количество активных спермиев в дозе.
Для этого применяется разработанный фотограмметрический метод.
Сущность метода оценки подвижности спермиев быков заключается в микрофотосъемке и подсчете движущихся спермиев после оттаивания.
Для этого необходимо иметь реактивы и аппаратуру для черно-белой обработки фотоматериалов, фотопленку чувствительностью 130 ГОСТ (160 ASA) 24 ?36 мм, трехзамещенный лимоннокислый натрий 2,8% раствор, баню водяную с постоянной температурой 37 ?0,5 0С, микроскоп с оптической системой, обеспечивающей увеличение в 60…140 раз (объектив 5 и окуляр 12…28?) для наблюдения и в 25 раз (объектив и окуляр фотонасадки 5?) для фотографирования с темнопольным конденсором и фотонасадкой, счетную камеру для подсчета клеток крови глубиной 100 микрометров, набор меланжеров и микропипеток.
- Дозу глубокозамороженной спермы в виде облицованных гранул, соломинок или пробирок помещают в водяную баню (t = 37 ±0,5 °С) до полного оттаивания. Концентрацию спермиев путем разбавления 2,8% раствором трехзамещенного лимоннокислого натрия при температуре 37±0,5 °С доводят до 1,5…2 млн в мл. Тщательно перемешивают пробу, микропипеткой заправляют подогретую (t =37±0,5 °С) счетную камеру и помещают ее на термостатирующий столик микроскопа.
- Устанавливают в микроскопе увеличение в 60…140 раз и добиваются резкого изображения объекта. Регулировкой системы освещения (применяется осветитель - 20 вт, 12 В с реостатом) добиваются эффекта темного поля, экспонируют 2 секунды три участка камеры на стандартную пленку (окуляр фотонасадки 5?, объектив 5?). При этом в каждом кадре размещают по 15 больших квадратов счетной камеры. Проявляют негативную пленку и готовят три фотографии. Живые спермии оставляют на фотографии трассы своего движения, а мертвые обычную форму. Это дает возможность различать на фотографии живые и мертвые спермии. После этого подсчитывают количество оставленных трасс на 3 фотографиях. Для подсчета отбирают 45 больших квадратов камеры общей площадью 1,8 мм2, ограничивающей объем 18?10 в минус 5 степени см3.
- Количество активных спермиев определяют по формуле:
где V1 – объем дозы спермы; n – количество подсчитанных спермиев в 45 квадратах; D – степень разбавления пробы спермы; V=18?10 в минус 5 степени см3 – объем, ограниченный 45 большими квадратами счетной камеры.
перейти к списку>>
Статьи по теме:
Другие статьи:
